豐富的種質(zhì)資源是漁業(yè)生產(chǎn)的重要物質(zhì)基礎(chǔ),保護和利用好海帶種質(zhì)資源將為提高海帶品種水平、實現(xiàn)海帶良種化生產(chǎn)提供重要保證,使我國這一具有傳統(tǒng)優(yōu)勢的重要產(chǎn)業(yè)在新世紀(jì)仍然保持世界領(lǐng)先水平。低溫生物學(xué)是探索低溫條件下生命現(xiàn)象的特征和規(guī)律,以及保存生物體、細(xì)胞的一門科學(xué)。生物細(xì)胞、組織、器官、胚胎甚至個體在超低溫(-196℃)狀態(tài)下代謝完全停止,生命以靜止的形式可以在這種狀態(tài)下長期保存,解凍后又可恢復(fù)其原有的生物活性和遺傳特性。將超低溫保存技術(shù)成功應(yīng)用于海帶種質(zhì)保存將有效解決藻類種質(zhì)保存中污染、混雜、變異的問題,可望實現(xiàn)藻類種質(zhì)的永久保存。 利用海帶孢子與配子體為試驗材料進行超低溫冷凍保存技術(shù)研究,主要取得了以下研究成果： 在海帶游(胚)孢子超低溫保存技術(shù)方面,降溫速率較快的兩步法可以成功凍存孢子,DMSO是對孢子毒性最小且對凍存最有效的抗凍保護劑。采用5%DMSO平衡50 min以內(nèi),10%DMSO或甘油平衡15分鐘以內(nèi),獲得了70%以上的配子體發(fā)生率。液氮相中預(yù)凍后投液氮的簡單方法獲得了50%存活率。降溫速率較快的方法適合孢子的冷凍保存,尤其是液面上方預(yù)凍后投液氮的方法可以獲得更高的存活率。復(fù)蘇后存活的孢子能萌發(fā)成配子體,配子體可無性繁殖,也可發(fā)育為孢子體,具有完全的再生能力。凍存孢子復(fù)蘇后,存活孢子形成的雄配子體比例約60%,顯著超過雌配子體40%的比例。超低溫冷凍顯著影響了復(fù)蘇孢子發(fā)育為配子體的性別比例(one-wayANOVA,F=15.441,p0.001)。 在海帶配子體超低溫保存技術(shù)方面,降溫速率較慢的兩步法可成功凍存配子體克隆,獲得了70%以上的存活率。降溫速率、預(yù)凍溫度及預(yù)凍時間對凍存復(fù)蘇后配子體的存活率均有顯著影響(p0.01),方差貢獻率量級依次為預(yù)凍溫度、預(yù)凍時間、降溫速率、降溫速率×預(yù)凍溫度、預(yù)凍溫度×預(yù)凍時間。在改善細(xì)胞抗凍性方面,預(yù)培養(yǎng)條件及性別的主效顯著；雄系較雌系具有較強的抗凍性。經(jīng)過凍存的海帶無性繁殖系可以繼續(xù)無性繁殖,也可發(fā)育為孢子體,具有完全的再生能力。 在海帶配子體克隆的膠囊化脫水法保存技術(shù)方面,脫水率和脫水速率綜合影響著凍存存活率,當(dāng)含水量超過70%或低于20%,導(dǎo)致所有細(xì)胞的死亡。在膠球20%-70%含水量之間,三種脫水方法的配子體復(fù)蘇存活率差異顯著。其中采用低溫冷藏柜陰干的干燥方法獲得了較高的平均存活率。采用陰干法將膠球含水量降低到40%時獲得了的存活率(one-way ANOVA,p0.01).在-40℃或-60℃下預(yù)凍30-60 min獲得了較高的存活率(one-way ANOVA, p0.01)。其中,當(dāng)膠球陰干脫水4 h,在-40℃或-60℃條件下預(yù)凍30 min效率。膠囊化脫水法與兩步凍存法結(jié)合顯示了對海帶配子體的超低溫保存較高的效率。膠囊化脫水法與兩步凍存法結(jié)合使用為干燥敏感型種類提供了可行辦法。不使用抗凍保護劑和昂貴的程序降溫儀可獲得43%的存活率。