(尿嘧啶DNA糖基化酶)
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用途
因PCR是一種極敏感的擴(kuò)增技術(shù)，易受污染的影響。小量的外源 DNA 污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來源的污染，這稱之為殘余污染；從其他樣品中純化的 DNA 或克隆的 DNA 也會(huì)是污染源。衛(wèi)生部已經(jīng)明確規(guī)定，凡是用于臨床檢驗(yàn)的PCR試劑，都應(yīng)該有 技術(shù)，以防止污染。
控制污染的方法主要有兩種：
1 、在 PCR 實(shí)驗(yàn)過程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟和實(shí)驗(yàn)環(huán)境減少殘余污染：使用抗氣霧劑移液管的阻止氣霧劑進(jìn)入 eppendorf 管內(nèi)；為 PCR 樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域；在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套；總是使用不含有模板的陰性對(duì)照檢測(cè)污染；使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試 劑單獨(dú)加入。
• 使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），這種酶（也稱為尿嘧啶 -N- 糖基化酶或）移除 DNA 中的尿嘧啶，在 PCR 反應(yīng)液配制時(shí)，將dUTP和dTTP 按一定的比例混用，使得擴(kuò)增產(chǎn)物含有脫氧尿嘧啶，這種產(chǎn)物對(duì) UNG 敏感，所有可以在 PCR 前對(duì)新配制的反應(yīng)用 UNG 處理以破壞殘余產(chǎn)物，杜絕污染。
特征
• 克隆有 Thermu aquaticus DNA Polymerase 基因的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，再經(jīng)三次過柱純化分離出來的重組蛋白。
• 50ul 體系中，加入 0.1U 的 UNG 酶，能夠消除 10 7 帶有 dUTP 的、大于 6 個(gè)堿基的雙鏈 DNA 污染。
• 反應(yīng)條件： 37 ℃ ， 2 分鐘；反應(yīng) buffer: 20mM Tris-HCl(PH:8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。
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